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Microscopie à fluorescence

1èreSVTTechnique d'études de la cellule vivanteMicroscopie à fluorescence~3 min de lecture

Un marquage fluorescent aide à localiser une cible si l’on distingue signal, excitation et fond.

Microscopie à fluorescence

Objectifs

  • Relier excitation et émission.
  • Comprendre un marquage ciblé.
  • Interpréter une image avec des témoins.

Excitation et émission

Un fluorochrome absorbe une lumière d’excitation et réémet une lumière de fluorescence. Dans les cas courants, la lumière émise a une longueur d’onde plus grande. Les filtres du microscope séparent excitation et émission : le détecteur reçoit le signal utile. Ce n’est pas une simple peinture éclairée.

flowchart LR
A[Lumiere excitation] --> B[Fluorochrome]
B --> C[Lumiere emise]
C --> D[Filtre emission]
D --> E[Detecteur]

Quelle lumière veut-on principalement détecter ?

  1. La lumière émise par le fluorochrome
  2. Toute la lumière de la lampe sans filtre
  3. Seulement l’ombre de la lame
On sépare le signal de fluorescence de la lumière qui excite le marqueur.

Localiser une molécule dans la cellule

Un fluorochrome peut être associé à un marqueur ciblant une structure. En immunofluorescence, un anticorps reconnaît une cible ; le dispositif de marquage lui associe un signal fluorescent. Des marqueurs d’organites et des protéines fluorescentes permettent aussi d’étudier des localisations. La couleur affichée sur l’image sert à représenter le signal et n’est pas nécessairement la couleur naturelle de l’organite.

Observation fictive : un anticorps marqué reconnaît une protéine étudiée. Le signal apparaît près de la périphérie cellulaire. Que peut-on proposer ?

Voir la solution après avoir cherché
Le marquage suggère une localisation périphérique de la cible dans ces conditions.
On compare avec le contour cellulaire et des témoins adaptés.
On ne conclut pas que la protéine se trouve uniquement là dans toutes les cellules et toutes les conditions.

Pourquoi utiliser un anticorps marqué ?

  1. Pour reconnaître une cible et en repérer le signal
  2. Pour faire grandir la cellule
  3. Pour remplacer toute vérification
La reconnaissance et le marqueur relient une molécule recherchée à un signal observable.

Vérifier la spécificité du signal

Un témoin sans marquage aide à repérer une fluorescence propre à l’échantillon ; un témoin adapté sans anticorps primaire peut révéler du marquage non spécifique dans une méthode indirecte. Il faut comparer des réglages cohérents. Une fluorescence plus forte ne prouve pas automatiquement une plus grande quantité de protéine : exposition, fond et efficacité du marquage interviennent aussi.

Cas fictif : le témoin sans marquage est aussi lumineux que la préparation étudiée. Peut-on attribuer toute la lumière à la cible ?

Voir la solution après avoir cherché
Non : le témoin montre qu’un signal existe sans le marquage recherché.
Il faut examiner le fond et la fluorescence propre de l’échantillon.
On revoit la méthode avant d’attribuer ce signal à la protéine.

Un signal fluorescent suffit-il toujours à prouver la présence de la cible ?

  1. Oui
  2. Non
L’interprétation dépend de la spécificité du marquage et des témoins.

Erreurs fréquentes

Résumé

Relie chaque signal au marqueur, à sa cible et aux témoins avant de conclure sur une localisation.

Cartes mémo : réponds avant de retourner

Fluorochrome
Molécule qui absorbe une excitation puis émet de la fluorescence.
Filtre d’émission
Sélectionne la lumière utile au détecteur.
Anticorps marqué
Permet d’associer une reconnaissance moléculaire à un signal.
Témoin
Condition de comparaison qui aide à interpréter le signal.
Localisation
Position suggérée par le signal dans les conditions étudiées.

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