Observation microscopique : du protocole à la mesure des cellules

Observer une cellule, c'est réussir une préparation, choisir le bon colorant et le bon instrument, puis savoir calculer et interpréter ce que l'on voit : grossissement, taille réelle et limite de résolution.

Ce cours est organisé comme une séance de travaux pratiques au lycée : on prépare la lame, on règle le microscope, on mesure, puis on apprend à ne pas se tromper dans l'interprétation d'une image.

Objectifs

Réaliser et justifier les étapes d'une préparation microscopique (montage, coupe, coloration).
Calculer un grossissement et la taille réelle d'une structure, à partir du champ ou d'une barre d'échelle.
Expliquer la notion de résolution et comparer microscope optique et microscope électronique.
Interpréter une image : reconnaître les structures, les artefacts et l'effet d'une coupe.

Les unités du monde cellulaire

On utilise le micromètre (µm) et le nanomètre (nm) :

\[1\ \text{mm} = 10^{3}\ \mu\text{m} \qquad 1\ \mu\text{m} = 10^{3}\ \text{nm}\]

Ordres de grandeur : une cellule de la joue mesure quelques dizaines de micromètres, une bactérie environ \(1\) à quelques \(\mu\text{m}\), un ribosome quelques dizaines de nanomètres.

Partie 1 : réussir une préparation

Les règles de base

L'objet doit être mince : la lumière doit le traverser. On prélève une fine pellicule (épiderme d'oignon), on fait un frottis (cellules de la joue, déposées en couche fine) ou on réalise une coupe fine à la lame de rasoir.
Montage entre lame et lamelle dans une goutte d'eau ou de colorant : on pose la lamelle en l'inclinant, d'un bord vers l'autre, pour chasser l'air.
Coloration : la plupart des structures cellulaires sont presque transparentes ; un colorant se fixe sur certaines d'entre elles et les rend visibles.

Quelques colorants et ce qu'ils révèlent

Colorant	Ce qu'il colore	Utilisation typique
Bleu de méthylène	Noyau (bleu foncé), cytoplasme (bleu clair)	Cellules animales, cellules de la joue
Eau iodée (lugol)	Amidon en bleu-noir	Grains d'amidon de la pomme de terre
Rouge neutre	Vacuoles en rouge, sur cellule vivante	Cellules végétales vivantes
Vert de méthyle acétique	Noyau en vert	Repérer les noyaux, cellules tuées et fixées

Exemple résolu 1 : choisir le bon protocole

Mariam veut prouver que la pomme de terre stocke de l'amidon dans des grains. Quel protocole propose-t-elle ? Cherche d'abord.

Voir la solution

Elle gratte délicatement la chair d'une pomme de terre coupée, dépose un peu de ce « jus » sur une lame, ajoute une goutte d'eau iodée, pose la lamelle en l'inclinant puis observe à faible grossissement avant de passer au plus fort. Les grains d'amidon apparaissent bleu-noir : le test est positif. Pour comparer, elle peut faire une lame témoin avec de l'eau seule, où les grains restent incolores.

Pourquoi pose-t-on la lamelle en l'inclinant ?

Pour colorer plus vite la préparation
Pour éviter d'emprisonner des bulles d'air
Pour augmenter le grossissement

En abaissant la lamelle d'un bord vers l'autre, on pousse l'air hors de la goutte. Les bulles d'air gênent l'observation et peuvent être confondues avec des cellules.

Partie 2 : régler le microscope et calculer

Le microscope optique utilise la lumière qui traverse l'objet. Deux systèmes de lentilles grossissent successivement l'image : l'objectif, près de l'objet, puis l'oculaire, où l'on place l'œil.

Place les noms des parties principales sur le schéma.

Le grossissement

Le grossissement total est le produit des grossissements de l'objectif et de l'oculaire :

\[G = G_{\text{objectif}} \times G_{\text{oculaire}}\]

Quand le grossissement est multiplié par 4, le diamètre du champ observé est divisé par 4 : on voit plus gros, mais une plus petite partie de la préparation.

Exemple résolu 2 : mesurer des cellules grâce au champ

Avec l'oculaire \(\times 10\) et l'objectif \(\times 10\), le diamètre du champ du microscope du lycée vaut \(1{,}8\ \text{mm}\). Mariam passe à l'objectif \(\times 40\) et compte environ 9 cellules de sa joue alignées sur un diamètre du champ. Quelle est la taille d'une cellule ?

Étape 1 : grossissements. \[G_1 = 10 \times 10 = 100 \qquad G_2 = 40 \times 10 = 400\] Le grossissement est multiplié par \(4\).

Étape 2 : nouveau diamètre du champ. \[D_2 = \frac{1{,}8\ \text{mm}}{4} = 0{,}45\ \text{mm}\]

Étape 3 : taille d'une cellule. \[\frac{0{,}45\ \text{mm}}{9} = 0{,}05\ \text{mm}\]

Étape 4 : conversion. \[0{,}05\ \text{mm} = 0{,}05 \times 1000\ \mu\text{m} = 50\ \mu\text{m}\] C'est bien l'ordre de grandeur d'une cellule animale.

Exemple résolu 3 : utiliser une barre d'échelle

Sur une photographie prise au microscope électronique, une barre d'échelle de \(2\ \text{cm}\) représente \(1\ \mu\text{m}\). Une mitochondrie mesure \(3\ \text{cm}\) de long sur la photo. Calcule sa taille réelle et le grandissement de la photo. Cherche d'abord.

Voir la solution

Taille réelle par proportionnalité :

\[L = \frac{3\ \text{cm}}{2\ \text{cm}} \times 1\ \mu\text{m} = 1{,}5\ \mu\text{m}\]

Grandissement : on compare la taille sur la photo et la taille réelle, dans la même unité. Comme \(2\ \text{cm} = 20\,000\ \mu\text{m}\) :

\[G = \frac{20\,000\ \mu\text{m}}{1\ \mu\text{m}} = 20\,000\]

La photo est agrandie \(20\,000\) fois.

Avec un oculaire ×10 et un objectif ×100, le grossissement total vaut :

×1000
×110
×10

On multiplie les deux grossissements : 10 × 100 = 1000. On ne les additionne pas.

Partie 3 : la résolution, limite de ce que l'on peut voir

La résolution (ou pouvoir séparateur) est la plus petite distance entre deux points que l'instrument permet encore de voir comme deux points distincts. Plus elle est petite, plus l'image est détaillée.

Grossir ne suffit pas : au-delà d'une certaine limite, l'image devient plus grande mais floue, sans nouveaux détails. Pour le microscope optique, cette limite vient de la lumière elle-même. Une formule classique (critère de Rayleigh) donne :

\[d = \frac{0{,}61\,\lambda}{ON}\]

où \(\lambda\) est la longueur d'onde de la lumière et \(ON\) l'ouverture numérique de l'objectif (une caractéristique gravée sur l'objectif).

Exemple résolu 4 : calculer une résolution

Données : lumière verte \(\lambda = 0{,}55\ \mu\text{m}\), objectif à immersion \(\times 100\) d'ouverture \(ON = 1{,}25\).

Calcul : \[d = \frac{0{,}61 \times 0{,}55}{1{,}25} \approx 0{,}27\ \mu\text{m}\]

Interprétation : deux structures plus proches que \(0{,}27\ \mu\text{m}\) environ se confondent. Un ribosome, de quelques dizaines de nanomètres, est donc invisible au microscope optique, même au plus fort grossissement.

Comparer les instruments

Instrument	Résolution (ordre de grandeur)	Ce que l'on peut voir
Œil nu	environ \(0{,}1\ \text{mm}\)	Un œuf de grenouille, à peine une grosse cellule
Microscope optique	environ \(0{,}2\ \mu\text{m}\)	Cellules, noyau, vacuole, chloroplastes, paroi
Microscope électronique à transmission (MET)	de l'ordre du nanomètre	Ultrastructure : membranes, réticulum, ribosomes, crêtes des mitochondries

Le MET utilise un faisceau d'électrons qui traverse une coupe ultrafine d'une cellule morte, fixée et contrastée : l'image est en noir et blanc (les couleurs des photos sont souvent ajoutées ensuite, ce sont de « fausses couleurs »). Le microscope électronique à balayage (MEB) montre la surface des objets, avec un effet de relief.

flowchart LR
  A[Oeil nu] -->|détails plus fins| B[Microscope optique]
  B -->|détails encore plus fins| C[Microscope électronique]
  A -.- D[Organes et tissus]
  B -.- E[Cellules et gros organites]
  C -.- F[Ultrastructure]

Pourquoi ne voit-on pas les ribosomes au microscope optique, même à ×1000 ?

Parce qu'ils sont transparents
Parce qu'il faudrait un grossissement ×2000
Parce que leur taille est inférieure à la résolution du microscope optique

La résolution du microscope optique est d'environ 0,2 µm, soit 200 nm. Un ribosome mesure quelques dizaines de nanomètres : même grossi davantage, il resterait flou et confondu.

Partie 4 : interpréter une image sans se tromper

Les pièges classiques

Les artefacts : bulles d'air (cercles à bord noir épais et brillant au centre), poussières, plis de la préparation. Ils ne font pas partie de la cellule.
L'effet de coupe : une coupe est une tranche, une image en deux dimensions d'un objet en trois dimensions. Un même organite allongé, coupé en travers, apparaît rond ; coupé en long, il apparaît allongé.
La mise au point : on ne voit net qu'un seul plan à la fois. En tournant doucement la vis de mise au point, on explore l'épaisseur de l'objet.
Les couleurs : la couleur vient souvent du colorant, pas de la cellule.

Une méthode d'interprétation en quatre questions

Quel instrument, quel grossissement ou quelle échelle ? Cela indique ce qu'on peut espérer voir.

Quelle préparation et quel colorant ? Cela indique quelle structure est colorée.

Quelles structures je reconnais, et sont-elles cohérentes avec leur taille ?

Ce que je vois pourrait-il être un artefact ou un effet de coupe ?

Exemple résolu 5 : cellule animale ou végétale ?

Une photo au microscope optique (×400, eau iodée) montre des cellules polygonales, accolées, entourées d'un contour épais et rigide, avec un noyau et des petits grains bleu-noir. Animale ou végétale ? Cherche d'abord.

Voir la solution

Le contour épais et rigide qui donne une forme polygonale est la paroi, propre aux cellules végétales. Les grains bleu-noir après eau iodée sont des grains d'amidon, réserve typique des végétaux. Il s'agit de cellules végétales, par exemple de pomme de terre. Une cellule animale, comme celle de la joue, n'a ni paroi ni amidon.

Sur une coupe, une mitochondrie apparaît ronde à un endroit et allongée à un autre. La meilleure explication est :

Il y a deux sortes de mitochondries
Elles ont été coupées selon des orientations différentes
Le colorant a déformé l'une d'elles

Une coupe montre une tranche d'un objet en trois dimensions : un organite allongé coupé en travers paraît rond, coupé en long il paraît allongé.

Erreurs fréquentes

Additionner les grossissements au lieu de les multiplier.
Confondre grossissement et résolution : grossir plus ne montre pas forcément plus de détails.
Oublier de convertir les unités (mm, µm, nm) avant un calcul de taille.
Commencer au plus fort objectif : on ne trouve rien et on risque d'écraser la lame.
Prendre une bulle d'air pour une cellule, ou une fausse couleur pour la couleur réelle.

Récapitulatif

Une bonne préparation est mince, montée sans bulles, et colorée selon ce que l'on veut voir.
\(G = G_{\text{objectif}} \times G_{\text{oculaire}}\) ; taille réelle = taille mesurée divisée par le grandissement, dans la même unité.
La résolution est la plus petite distance séparable : environ \(0{,}2\ \mu\text{m}\) au microscope optique, de l'ordre du nanomètre au MET.
Interpréter, c'est tenir compte de l'instrument, du colorant, des artefacts et de l'effet de coupe.

Grossissement total

Grossissement de l'objectif multiplié par celui de l'oculaire.

Résolution

Plus petite distance entre deux points encore vus séparés.

Colorant vital

Colorant qui ne tue pas la cellule, comme le rouge neutre.

Artefact

Élément visible qui ne fait pas partie de l'objet : bulle, poussière, pli.

MET

Microscope électronique à transmission : ultrastructure, coupes ultrafines, cellules mortes.